以色胺酸及FlAsH組成之凋亡蛋白酶3螢光感測多肽

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姓名

鄭皓蔚(Hao-Wei Cheng) 查詢紙本館藏

畢業系所

化學學系

論文名稱

以色胺酸及FlAsH組成之凋亡蛋白酶3螢光感測多肽
(FlAsH Labeled Peptide with Tryptophan Residues as a Caspase-3 Sensor)

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摘要(中)

本論文是以色胺酸對螢光團螢光淬滅的特性為基礎，設計並合成蛋白酶活性
感測器 FlAsH-3W2F-TCǶ利用一系列 FlAsH 螢光染料標示胜肽的螢光性質進行研究，發現帶有芳香環側鏈的胺基酸中，相較於阻胺酸與苯Ҙ胺酸，色胺酸對FlAsH 螢光染料的螢光有最好的淬滅效果；胜肽上的色胺酸數量越多對螢光的淬滅效果也越好Ƕ色胺酸對於螢光染料的淬滅是根據光誘發電子轉移，透過螢光分子與色胺酸之間碰撞所形成暫時的分子軌域，提供電子轉移的通道，使螢光團激發的能量得到鬆弛Ƕ在以 Trypsin 為模型的蛋白酶活性實驗中，感測器水解前後有將近 9 倍的螢光強度增加；在 Caspase-3 目標蛋白酶活性實驗中，也觀測到明顯的螢光增強Ƕ以色胺酸做為淬滅團在螢光感測器上的應用是可行的。

摘要(英)

We synthesized a Caspase-3 sensor, FlAsH-3W2F-TC, whose fluorescence was quenched by tryptophan inside the peptidyl sensor backbone. By studying a series of FlAsH-labeled peptide sequences, tryptophan containing peptide sequence showed higher quenching ability than histidine and phenylalanine peptide sequences; the more tryptophan the peptide sequence contains, the higher quenching efficiency we get. The quenching phenomena is based on photo-induced electron transfer(PET). The excited fluorophore relax by conducting an electron through temporary collisional molecular orbital. In trypsin model experiment, our sensor showed ~9-fold fluorescence increasing after hydrolysis; in Caspase-3 experiment, our sensor also showed significant fluorescence increasing. Finally, the application of tryptophan as a natural quencher in peptidyl fluorescent sensor is feasible and potential.

關鍵字(中)

★ 感測器
★ 凋亡蛋白酶3
★ 螢光

關鍵字(英)

論文目次

目錄
中文摘要 ---------------------------------------------------------------------------- I
英文摘要 ---------------------------------------------------------------------------- II
致謝 ---------------------------------------------------------------------------- III
目錄 ---------------------------------------------------------------------------- IV
圖目錄 ---------------------------------------------------------------------------- VIII
表目錄 ---------------------------------------------------------------------------- XV

第一章緒論 ---------------------------------------------------------------------- 1
1-1 細胞凋亡(Apoptosis) ------------------------------------------------- 1
1-1-1 外在路徑誘發細胞凋亡(Extrinsic pathway of cell apoptosis) - 2
1-1-2 內在路徑誘發細胞凋亡(Intrinsic pathway of cell apoptosis) -- 3
1-1-3 藥物引發細胞凋亡 ---------------------------------------------------- 3
1-1-4 亡蛋白酶(Caspase) --------------------------------------------------- 4
1-1-4-1 細胞凋亡蛋白酶-3 (Caspase-3) ------------------------------------ 6
1-2 螢光生物感測 ---------------------------------------------------------- 6
1-2-1 生物感測 ---------------------------------------------------------------- 6
1-2-1-1 概述 ---------------------------------------------------------------------- 6
1-2-1-2 辨識元件(Recognition unit) ----------------------------------------- 6
1-2-1-3 訊號轉換器(Signal transducer) ------------------------------------- 7
1-2-2 螢光發光團(Fluorophore) ------------------------------------------ 8
1-2-2-1 原理 ---------------------------------------------------------------------- 8
1-2-2-2 螢光染料 ---------------------------------------------------------------- 8
1-2-2-3 螢光蛋白質 ------------------------------------------------------------- 8
1-2-3 淬滅團(Quencher) ---------------------------------------------------- 9 V

1-2-3-1 原理 ---------------------------------------------------------------------- 9
1-2-3-2 Fröster 共振能量轉移(Fröster Resonance Energy Transfer,
FRET) -------------------------------------------------------------------

10
1-2-3-3 光誘發電子轉移 (Photoinduced Electron Transfer, PET) ----- 10
1-2-4 化學合成螢光生物感測 ---------------------------------------------- 11
1-2-5 基因表達螢光生物感測 ---------------------------------------------- 11
1-2-6 半基因表達合成螢光生物感測 ------------------------------------- 12

第二章文獻回顧與設計構想 ------------------------------------------------- 13
2-1 凋亡蛋白酶的檢測方式 ---------------------------------------------- 13
2-1-1 比色法定量Caspase-3 活性 ------------------------------------------ 13
2-1-2 單一螢光團定量Caspase-3活性 ------------------------------------ 14
2-1-3 FRET 定量 Caspase-3 活性感測 ------------------------------------ 17
2-1-4 奈米粒子Caspase-3活性感測 --------------------------------------- 18
2-1-5 螢光蛋白質對Caspase-3活性感測 --------------------------------- 23
2-1-6 自聚集誘發螢光 (Aggregation-induced emission，AIE) 染料
Caspase-3 活性偵測器 ------------------------------------------------

27
2-2 色胺酸對螢光團淬滅 ------------------------------------------------- 30
2-3 針對 Caspase-3 活性感測器的構想 ------------------------------- 36
2-4 實驗設計與現存感測器的差別比較 ------------------------------- 38

第三章結果與討論 ------------------------------------------------------------- 39
3-1 胜肽合成 ---------------------------------------------------------------- 39
3-2 螢光染料標識胜肽 ---------------------------------------------------- 40
3-3 胜肽序列對 FlAsH 螢光淬滅效果比較 -------------------------- 41 VI

3-4 Trypsin 實驗 FlAsH 標識胜肽螢光恢復能力 ------------------- 43
3-5 Caspase-3 實驗螢光恢復能力 -------------------------------------- 45
3-6 Caspase-3 定性及定量 ------------------------------------------------ 47
3-6-1 SDS-page 定性 --------------------------------------------------------- 48
3-6-2 Caspase-3 活性測量 --------------------------------------------------- 49
3-6-2-1 pNA 校正曲線 --------------------------------------------------------- 49
3-6-2-2 Caspase-3 活性測量與計算 ------------------------------------------ 49
3-7 環境溫度對 Caspase-3 活性的迎想 -------------------------------- 50
3-8 溶液中蛋白質對 FlAsH-TC 螢光強度隨時間下降的影響 ----- 51
3-9 BSA 對 FlAsH-3W2F-TC 螢光的影響 ----------------------------- 52

第四章結論 ---------------------------------------------------------------------- 54

第五章實驗方法 ---------------------------------------------------------------- 55
5-1 實驗儀器 ---------------------------------------------------------------- 55
5-2 實驗藥品 ---------------------------------------------------------------- 55
5-3 實驗步驟 ---------------------------------------------------------------- 57
5-3-1 Caspase-3 感測器 ----------------------------------------------------- 57
5-3-1-1 固態胜肽合成 ---------------------------------------------------------- 57
5-3-1-2 胜肽純化 ---------------------------------------------------------------- 58
5-3-1-3 FlAsH 螢光標識 ------------------------------------------------------ 59
5-3-1-4 FlAsH 標釋胜肽定量 ------------------------------------------------ 60
5-3-1-5 蛋白質對感測器螢光增強實驗 ------------------------------------- 60
5-3-2 Caspase-3 表現與純化 ----------------------------------------------- 61
5-3-2-1 培養基配置 ------------------------------------------------------------- 61 5-3-2-2 pET23b-Casp3-His 質體放大及純化 ------------------------------- 61
5-3-2-3 Caspase-3 表現 -------------------------------------------------------- 62
5-3-2-4 凋亡蛋白酶活性測量 ------------------------------------------------- 63
5-3-3 溶液配置 ---------------------------------------------------------------- 64

參考文獻 ---------------------------------------------------------------------------- 65
附錄一光譜資料 ---------------------------------------------------------------- 70
附錄二 Fluorecein / TAMRA FRET 對的感測器設計 --------------------- 80

參考文獻

65

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指導教授

李賢明、謝發坤(Hsein-Ming Lee Fa-Kuen Shieh)

審核日期

2015-6-15

推文