建立安全的誘導性幹細胞的重新編寫方法;Developing a reprogramming method for generating safe induced pluripotent stem cells

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題名:	建立安全的誘導性幹細胞的重新編寫方法;Developing a reprogramming method for generating safe induced pluripotent stem cells
作者:	簡嘉瑩;Chia-ying Chien
貢獻者:	生命科學研究所
關鍵詞:	重新編寫;誘導性幹細胞;重組蛋白;細胞穿透序列;短暫通透性細胞膜;鏈球菌溶血素O;streptolysin-O;plasma membrane transiently permeable;cell penetrating peptides;recombinant proteins;iPSC;reprogramming
日期:	2012-02-01
上傳時間:	2012-06-15 20:11:32 (UTC+8)
摘要:	幹細胞分化成各種型態細胞的能力稱之為多能性，但終端分化的體細胞則失去了這些多能性。在近年的研究中發現，將體細胞大量表現特定的幹細胞轉錄因子 (Yamanaka 因子, YFs) ，可使細胞重新編寫(reprogram)成具有多能性的細胞，這些即所謂的誘導性幹細胞 (iPSC)。然而YFs通常是透過反轉錄病毒介導方式送入，細胞中大量表現，導致基因體的嵌入現象，引發插入性突變嚴重的關切。隨著iPSC研究的進步，漸漸發展出許多安全性誘導iPSC產生的reprogramming方式，其中像是(1) 利用具有可回復的短暫通透性細胞膜之細胞，再加入ES 細胞的萃取液培養，(2) 或是利用帶有細胞通透序列的YFs重組蛋白，來誘導iPSC的產生。雖然這兩種方式避免了基因體的嵌入性突變，但其產生iPSC的效率非常低。因此我們想要利用結合這兩種方式，將具有通透性的體細胞同時加入帶有細胞通透序列的YFs重組蛋白，來增加iPSC的產生效率。首先，建立攜帶由Oct4啟動子驅動的報導基因Oct4-puromycine 或 Oct4-luciferase-IRES-GFP的穩定纖維母細胞株，接著利用鏈球菌溶血素 (SLO) 將細胞膜產生短暫通透性，最後再加入YFs重組蛋白促使細胞reprogram並產生多能性，並且檢測puromycin或是GFP的表現篩檢reprogramming的能力。現階段利用細菌系統表現的GST-Oct4、GST-Nanog、Sox2 LpRH、Lin28 LpRH 和 c-Myc LpRH蛋白，同時加入小分子物質 (VPA、BIX-01294和 EVR) 來誘導通透性纖維母細胞的多能性，目前已進行數次reprogramming 的實驗，但成功的比率偏低。未來希望可利用昆蟲系統表現YFs重組蛋白，增加具有轉譯後修飾作用YFs。如果成功誘導iPSC產生後，可再進一步測定細胞的多能性，確認是否會產生類似ES cell的colony現象，以及判定內部的基因表現情形，或是胚胎體 (embroid body)形成的分化測試。Stem　cells　can　differentiate　into　most　cell　types　while　differentiated　somatic　cells　have　lost　this　pluripotency.　　Recent　studies　have　shown　that　somatic　cells　can　be　reprogrammed　by　over-expression　of　defined　transcription　factors　(Yamanaka　factors,　YFs)　to　become　pluripotent　stem　cell　(called　as　induced　pluripotent　stem　cells,　iPSC).　　Over-expression　of　YFs　is　usually　mediated　by　retrovirus　and　whose　integration　into　genome　raises　serious　concern　about　the　insertional　mutagenesis.　　To　develop　safer　iPSC,　one　reprogramming　method　has　incubated　reversibly　permeable　target　cells　in　ES　cell　extracts　and　another　has　used　recombinant　cell–penetrating　YFs　proteins　to　generated　iPSC.　　Although　these　two　methods　avoid　insertional　mutagenesis,　unfortunately,　they　generate　iPSC　with　only　low　efficiency.　　Therefore,　we　like　to　combine　these　two　approaches　by　treating　somatic　cells　with　permeable　system　and　cell-penetrating　YFs　proteins　simultaneously　to　increase　the　reprogramming　efficiency.　　Firstly,　stable　clones　of　fibroblasts　carrying　Oct4　promoter　driven　puromycine　or　IRES-GFP　reporter　genes　were　established,　then,　they　were　treated　with　streptolysin-O　(SLO)　to　make　their　plasma　membrane　transiently　permeable.　　Finally,　recombinant　YFs　proteins　will　be　added　to　reprogram　them　to　pluripotent　state　and　the　reprogramming　efficiency　will　be　examined　by　puromycin　or　GFP　selection.　　Currently,　the　pluripotency　of　permeable　fibroblasts　were　induced　by　bacterially　expressed　GST-Oct4、GST-Nanog、Sox2　LpRH、Lin28　LpRH　and　c-Myc　LpRH　proteins　in　the　presence　of　small　compounds　(VPA、BIX-01294　and　EVR).　Unfortunately,　the　reprogramming　efficiency　is　rather　low.　　In　the　future,　YFs　proteins　will　be　expressed　by　insect　cells　that　allow　post-translational　modification　of　these　factors.　　Once　iPSC　clones　have　been　generated,　their　pluripotent　state　will　be　examined　by　ES-like　colony　formation,　gene　expression　profiling　assays,　and　embryoid　body　formation.
顯示於類別:	[生命科學研究所 ] 博碩士論文

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