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    題名: 利用逆相管柱層析並輔以溶解度參數計算進行聚乙烯二醇化人類副甲狀腺素位置異構物之分離;Separation of Positional Mono-PEGylated Teriparatide Isomers Using Reverse-Phased Chromatography Assisted by Solubility Parameter Calculation
    作者: 高偉紘;Kao,Wei-hung
    貢獻者: 化學工程與材料工程學系
    關鍵詞: 聚乙烯二醇化;胜?位置異構物;人類副甲狀腺素;逆相管柱曾析;溶解度參數;PEGylation;Peptide positional isomers;Human parathyroid hormone;Reversed-phase chromatography;Solubility parameter
    日期: 2013-08-15
    上傳時間: 2013-10-08 15:07:15 (UTC+8)
    出版者: 國立中央大學
    摘要: Teriparatide為人類副甲狀腺素(human parathyroid hormone, PTH)中1到34胺基酸片段。於2002年,美國食品藥物管理局核可Teriparatide作為治療療骨質疏鬆症(osteoporosis)的胜?藥物。Teriparatide主要是藉由皮下注射方式進行給藥,但藥物進入血液中的穩定性常因蛋白脢分解或是肝腎排除,而造成藥物穩定性下降或是藥效減弱。藥物聚乙烯二醇化(PEGylation)可降低肝腎排除的機率,並同時延長藥物在人體作用的循環時間。因此本研究以Teriparatide為目標分子,分別從聚乙烯二醇化的反應條件、初步分離、接枝位置的鑑定、二級結構分析,以及耐酵素降解測試,進一步的以逆相管柱層析分離聚乙烯二醇化胜?之位置異構物,並透過移動相pH值調控以及溶解度參數(solubility parameters)計算的方式,了解影響異構物分離之間的作用力,提出分離純化聚乙烯二醇化胜?的優化程序。

    在合成 PEGylated Teriparatide方面,本研究藉由調控反應溶劑之pH值可得不同單一PEG5K接枝位置之Teriparatide位置異構物,經由Lysine C切割證明當反應溶劑在pH 6時,PEG5K大多接枝於Teriparatide 的N端;而反應溶劑在pH 8時,PEG5K多接於Teriparatide 的Lys13。此外也發現Teriparatide的結構螺旋性(Helicity)會因PEG5K的接枝而稍微降低,但此二位置異構物抵抗胰蛋白脢水解之能力也因PEG接枝而大幅提升。在逆相層析純化分離N端與Lys13接枝PEG5K的Teriparatide方面,結果發現隨著沖堤溶劑之pH 值提高,由於一級胺質子化程度之差異,導致於異構物間的極性不同,使得此二位置異構物有較佳之分離效果。進一步的以溶解度參數計算發現,可藉由調整溶劑之組成,使二位置異構物與溶劑間之極性項(delta P
    polarity term of solubility parameter)的差異增加,以利於基線分離,此結果與調整移動相溶劑pH值之結果相符。由本研究得知,溶劑組成與pH值之調整均可改變分子的極性差異,以利於N端與Lys13接枝PEG的胜?異構物達基線分離。
    Teriparatide, a peptide drug for treating to osteoporosis by once-daily injection, is the 1-34 segment of recombinant human parathyroid hormone. However, Teriparatide is proteolytically instable in human serum resulting in short circulation half-life (less than 1 hour). Therefore, conjugation with polyethylene glycol (PEGylation) to Teriparatide may shield it from proteolysis to prolong the circulation half-life. For the PEGylated Teriparatide, the positional isomers are usually formed with random PEGylation. We obtained the Nter-PEGylated and K13-PEGylated Teriparatide while the synthesis conditions using pH 6.0 and pH8.0 phosphate buffer, respectively. In this investigation, we intended to directly separate the isomers by tuning mobile phase pH in reversed-phase chromatography (RPC) operation. The results showed that the baseline separation of two isomers can be achieved by tuning the pH value of mobile phase from 7.0 to 9.0, and Nter-PEGylated Teriparatide is much retained in RPC. Form the solubility parameter measurement, we examined that the key factor for the separation of these two isomers is the polarity difference rather than hydrogen bonding or dispersion force. From the circular dichroism measurement, the K13- PEGylated Teriparatide with higher helixity shows less retained in RPC. The results are coherent with our previously proposed structure-retention relationships for peptide isomer retention prediction in RPC.
    顯示於類別:[化學工程與材料工程研究所] 博碩士論文

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