博碩士論文 101223025 詳細資訊




以作者查詢圖書館館藏 以作者查詢臺灣博碩士 以作者查詢全國書目 勘誤回報 、線上人數:14 、訪客IP:3.210.201.170
姓名 鄭皓蔚(Hao-Wei Cheng)  查詢紙本館藏   畢業系所 化學學系
論文名稱 以色胺酸及FlAsH組成之凋亡蛋白酶3螢光感測多肽
(FlAsH Labeled Peptide with Tryptophan Residues as a Caspase-3 Sensor)
相關論文
★ 天然物 Faveline methyl ether 之合成研究★ 人體突變生長激素受質膜內區段與半乳醣凝集素-12的表現、純化與結晶
★ 研究新型奈米粒子載體結合核糖核酸干擾調控在細胞內蛋白之表現★ 具芳香環胺基酸與內環狀結構之中孔洞材料的合成、鑑定與應用
★ 以手性亞碸催化劑進行醛的不對稱乙基化反應之研究★ 噁噻硼烷-氯化鎵錯合物催化不對稱 Diels-Alder 反應之研究
★ 開發心肌缺氧後再灌流傷害用藥與近紅外光染劑的高效率微脂體包覆方法★ Total Synthesis of Pikrosalvin, Simplexene C, D and Synthetic Studies toward Swartziarboreol G and Simplexene B
★ Understanding the Depolymerization of Biomass-derived Polysaccharides: Recrystallization while Hydrolyzing Polysaccharides★ 流感病毒血球凝集素(II)膜外區域之物理化學特性分析
★ 中孔洞材料SBA-15及其官能基化衍生材料對溶液中污染物之吸附應用★ 人類生長激素受體細胞膜內部份的純化與結構探討
★ D式甘露胺醣及其衍生物合成之研究★ 利用Trigger factor以及FKBP12兩種伴護蛋白來調控聚麩胺醯酸蛋白聚集化現象
★ 微孔洞材料-類沸石咪唑骨架材料(ZIF)與中孔洞材料的研究與應用★ 微孔洞材料-類沸石咪唑骨架材料(ZIF-90)與中孔洞材料-SBA-15的官能基修飾研究
檔案 [Endnote RIS 格式]    [Bibtex 格式]    [相關文章]   [文章引用]   [完整記錄]   [館藏目錄]   [檢視]  [下載]
  1. 本電子論文使用權限為同意立即開放。
  2. 已達開放權限電子全文僅授權使用者為學術研究之目的,進行個人非營利性質之檢索、閱讀、列印。
  3. 請遵守中華民國著作權法之相關規定,切勿任意重製、散佈、改作、轉貼、播送,以免觸法。

摘要(中) 本論文是以色胺酸對螢光團螢光淬滅的特性為基礎,設計並合成蛋白酶活性
感測器 FlAsH-3W2F-TCǶ利用一系列 FlAsH 螢光染料標示胜肽的螢光性質進行研究,發現帶有芳香環側鏈的胺基酸中,相較於阻胺酸與苯Ҙ胺酸,色胺酸對FlAsH 螢光染料的螢光有最好的淬滅效果;胜肽上的色胺酸數量越多對螢光的淬滅效果也越好Ƕ色胺酸對於螢光染料的淬滅是根據光誘發電子轉移,透過螢光分子與色胺酸之間碰撞所形成暫時的分子軌域,提供電子轉移的通道,使螢光團激發的能量得到鬆弛Ƕ在以 Trypsin 為模型的蛋白酶活性實驗中,感測器水解前後有將近 9 倍的螢光強度增加;在 Caspase-3 目標蛋白酶活性實驗中,也觀測到明顯的螢光增強Ƕ以色胺酸做為淬滅團在螢光感測器上的應用是可行的。
摘要(英) We synthesized a Caspase-3 sensor, FlAsH-3W2F-TC, whose fluorescence was quenched by tryptophan inside the peptidyl sensor backbone. By studying a series of FlAsH-labeled peptide sequences, tryptophan containing peptide sequence showed higher quenching ability than histidine and phenylalanine peptide sequences; the more tryptophan the peptide sequence contains, the higher quenching efficiency we get. The quenching phenomena is based on photo-induced electron transfer(PET). The excited fluorophore relax by conducting an electron through temporary collisional molecular orbital. In trypsin model experiment, our sensor showed ~9-fold fluorescence increasing after hydrolysis; in Caspase-3 experiment, our sensor also showed significant fluorescence increasing. Finally, the application of tryptophan as a natural quencher in peptidyl fluorescent sensor is feasible and potential.
關鍵字(中) ★ 感測器
★ 凋亡蛋白酶3
★ 螢光
關鍵字(英)
論文目次 目錄
中文摘要 ---------------------------------------------------------------------------- I
英文摘要 ---------------------------------------------------------------------------- II
致謝 ---------------------------------------------------------------------------- III
目錄 ---------------------------------------------------------------------------- IV
圖目錄 ---------------------------------------------------------------------------- VIII
表目錄 ---------------------------------------------------------------------------- XV

第一章 緒論 ---------------------------------------------------------------------- 1
1-1 細胞凋亡(Apoptosis) ------------------------------------------------- 1
1-1-1 外在路徑誘發細胞凋亡(Extrinsic pathway of cell apoptosis) - 2
1-1-2 內在路徑誘發細胞凋亡(Intrinsic pathway of cell apoptosis) -- 3
1-1-3 藥物引發細胞凋亡 ---------------------------------------------------- 3
1-1-4 亡蛋白酶(Caspase) --------------------------------------------------- 4
1-1-4-1 細胞凋亡蛋白酶-3 (Caspase-3) ------------------------------------ 6
1-2 螢光生物感測 ---------------------------------------------------------- 6
1-2-1 生物感測 ---------------------------------------------------------------- 6
1-2-1-1 概述 ---------------------------------------------------------------------- 6
1-2-1-2 辨識元件(Recognition unit) ----------------------------------------- 6
1-2-1-3 訊號轉換器(Signal transducer) ------------------------------------- 7
1-2-2 螢光發光團(Fluorophore) ------------------------------------------ 8
1-2-2-1 原理 ---------------------------------------------------------------------- 8
1-2-2-2 螢光染料 ---------------------------------------------------------------- 8
1-2-2-3 螢光蛋白質 ------------------------------------------------------------- 8
1-2-3 淬滅團(Quencher) ---------------------------------------------------- 9 V

1-2-3-1 原理 ---------------------------------------------------------------------- 9
1-2-3-2 Fröster 共振能量轉移(Fröster Resonance Energy Transfer,
FRET) -------------------------------------------------------------------

10
1-2-3-3 光誘發電子轉移 (Photoinduced Electron Transfer, PET) ----- 10
1-2-4 化學合成螢光生物感測 ---------------------------------------------- 11
1-2-5 基因表達螢光生物感測 ---------------------------------------------- 11
1-2-6 半基因表達合成螢光生物感測 ------------------------------------- 12

第二章 文獻回顧與設計構想 ------------------------------------------------- 13
2-1 凋亡蛋白酶的檢測方式 ---------------------------------------------- 13
2-1-1 比色法定量Caspase-3 活性 ------------------------------------------ 13
2-1-2 單一螢光團定量Caspase-3活性 ------------------------------------ 14
2-1-3 FRET 定量 Caspase-3 活性感測 ------------------------------------ 17
2-1-4 奈米粒子Caspase-3活性感測 --------------------------------------- 18
2-1-5 螢光蛋白質對Caspase-3活性感測 --------------------------------- 23
2-1-6 自聚集誘發螢光 (Aggregation-induced emission,AIE) 染料
Caspase-3 活性偵測器 ------------------------------------------------

27
2-2 色胺酸對螢光團淬滅 ------------------------------------------------- 30
2-3 針對 Caspase-3 活性感測器的構想 ------------------------------- 36
2-4 實驗設計與現存感測器的差別比較 ------------------------------- 38

第三章 結果與討論 ------------------------------------------------------------- 39
3-1 胜肽合成 ---------------------------------------------------------------- 39
3-2 螢光染料標識胜肽 ---------------------------------------------------- 40
3-3 胜肽序列對 FlAsH 螢光淬滅效果比較 -------------------------- 41 VI

3-4 Trypsin 實驗 FlAsH 標識胜肽螢光恢復能力 ------------------- 43
3-5 Caspase-3 實驗螢光恢復能力 -------------------------------------- 45
3-6 Caspase-3 定性及定量 ------------------------------------------------ 47
3-6-1 SDS-page 定性 --------------------------------------------------------- 48
3-6-2 Caspase-3 活性測量 --------------------------------------------------- 49
3-6-2-1 pNA 校正曲線 --------------------------------------------------------- 49
3-6-2-2 Caspase-3 活性測量與計算 ------------------------------------------ 49
3-7 環境溫度對 Caspase-3 活性的迎想 -------------------------------- 50
3-8 溶液中蛋白質對 FlAsH-TC 螢光強度隨時間下降的影響 ----- 51
3-9 BSA 對 FlAsH-3W2F-TC 螢光的影響 ----------------------------- 52

第四章 結論 ---------------------------------------------------------------------- 54

第五章 實驗方法 ---------------------------------------------------------------- 55
5-1 實驗儀器 ---------------------------------------------------------------- 55
5-2 實驗藥品 ---------------------------------------------------------------- 55
5-3 實驗步驟 ---------------------------------------------------------------- 57
5-3-1 Caspase-3 感測器 ----------------------------------------------------- 57
5-3-1-1 固態胜肽合成 ---------------------------------------------------------- 57
5-3-1-2 胜肽純化 ---------------------------------------------------------------- 58
5-3-1-3 FlAsH 螢光標識 ------------------------------------------------------ 59
5-3-1-4 FlAsH 標釋胜肽定量 ------------------------------------------------ 60
5-3-1-5 蛋白質對感測器螢光增強實驗 ------------------------------------- 60
5-3-2 Caspase-3 表現與純化 ----------------------------------------------- 61
5-3-2-1 培養基配置 ------------------------------------------------------------- 61 5-3-2-2 pET23b-Casp3-His 質體放大及純化 ------------------------------- 61
5-3-2-3 Caspase-3 表現 -------------------------------------------------------- 62
5-3-2-4 凋亡蛋白酶活性測量 ------------------------------------------------- 63
5-3-3 溶液配置 ---------------------------------------------------------------- 64

參考文獻 ---------------------------------------------------------------------------- 65
附錄一 光譜資料 ---------------------------------------------------------------- 70
附錄二 Fluorecein / TAMRA FRET 對的感測器設計 --------------------- 80
參考文獻 65

參考文獻:
(1) Elmore, S. Toxicologic Pathology. 2007, 35, 495.
(2) Peterson, Q. P.; Goode, D. R.; West, D. C.; Botham, R. C.; Hergenrother, P.
J. Nature Protocols. 2010, 5, 294.
(3) Majno, G.; Joris, I. American Journal of Pathology. 1995, 146, 3.
(4) Janicke, R. U.; Sprengart, M. L.; Wati, M. R.; Porter, A. G. Journal of
Biological Chemistry 1998, 273, 9357.
(5) Cohen, G. M. Biochemical Journal. 1997, 326, 1.
(6) Fadok, V. A.; Savill, J. S.; Haslett, C.; Bratton, D. L.; Doherty, D. E.;
Campbell, P. A.; Henson, P. M. Journal of Immunology 1992, 149, 4029.
(7) Smith, C. A.; Farrah, T.; Goodwin, R. G. Cell 1994, 76, 959.
(8) Ashkenazi, A.; Dixit, V. M. Science 1998, 281, 1305.
(9) Green, D. R.; Reed, J. C. Science 1998, 281, 1309.
(10) Fulda, S.; Debatin, K. M. Oncogene 2006, 25, 4798.
(11) Liu, X. S.; Kim, C. N.; Yang, J.; Jemmerson, R.; Wang, X. D. Cell 1996, 86,
147.
(12) Zou, H.; Henzel, W. J.; Liu, X. S.; Lutschg, A.; Wang, X. D. Cell 1997, 90,
405.
(13) Yang, J.; Liu, X. S.; Bhalla, K.; Kim, C. N.; Ibrado, A. M.; Cai, J. Y.; Peng,
T. I.; Jones, D. P.; Wang, X. D. Science 1997, 275, 1129.
(14) Aas, T.; Borresen, A. L.; Geisler, S.; SmithSorensen, B.; Johnsen, H.;
Varhaug, J. E.; Akslen, L. A.; Lonning, P. E. Nature Medicine 1996, 2, 811.
(15) Wang, S. W.; Konorev, E. A.; Kotamraju, S.; Joseph, J.; Kalivendi, S.;
Kalyanaraman, B. Journal of Biological Chemistry 2004, 279, 25535.
(16) Nicolier, M.; Decrion-Barthod, A.-Z.; Launay, S.; Pretet, J.-L.; Mougin, C.
Biology of the Cell 2009, 101, 455. 66

(17) Belmokhtar, C. A.; Hillion, J.; Segal-Bendirdjian, E. Oncogene 2001, 20,
3354.
(18) Chae, H.-J.; Kang, J.-S.; Byun, J.-O.; Han, K.-S.; Kim, D.-U.; Oh, S.-M.;
Kim, H.-M.; Chae, S.-W.; Kim, H.-R. Pharmacological Research 2000, 42, 373.
(19) Pop, C.; Salvesen, G. S. Journal of Biological Chemistry 2009, 284, 21777.
(20) Johansson, M. K.; Cook, R. M. Chemistry-a European Journal. 2003, 9,
3466.
(21) Ward, M. D. Chemical Society Reviews. 1997, 26, 365.
(22) Torimura, M.; Kurata, S.; Yamada, K.; Yokomaku, T.; Kamagata, Y.;
Kanagawa, T.; Kurane, R. Analytical sciences : the international journal of the Japan
Society for Analytical Chemistry 2001, 17, 155.
(23) de Silva, A. P.; Moody, T. S.; Wright, G. D. Analyst 2009, 134, 2385.
(24) Doose, S.; Neuweiler, H.; Sauer, M. ChemPhysChem 2005, 6, 2277.
(25) Doose, S.; Neuweiler, H.; Sauer, M. ChemPhysChem 2009, 10, 1389.
(26) Zhang, J.; Campbell, R. E.; Ting, A. Y.; Tsien, R. Y. Nature reviews.
Molecular cell biology 2002, 3, 906.
(27) Hoffmann, C.; Gaietta, G.; Bunemann, M.; Adams, S. R.; Oberdorff-Maass,
S.; Behr, B.; Vilardaga, J. P.; Tsien, R. Y.; Eisman, M. H.; Lohse, M. J. Nature
Methods. 2005, 2, 171.
(28) Thornberry, N. A.; Bull, H. G.; Calaycay, J. R.; Chapman, K. T.; Howard, A.
D.; Kostura, M. J.; Miller, D. K.; Molineaux, S. M.; Weidner, J. R.; Aunins, J.;
Elliston, K. O.; Ayala, J. M.; Casano, F. J.; Chin, J.; Ding, G. J. F.; Egger, L. A.;
Gaffney, E. P.; Limjuco, G.; Palyha, O. C.; Raju, S. M.; Rolando, A. M.; Salley, J. P.;
Yamin, T. T.; Lee, T. D.; Shively, J. E.; Maccross, M.; Mumford, R. A.; Schmidt, J. A.;
Tocci, M. J. Nature 1992, 356, 768.
(29) Rotonda, J.; Nicholson, D. W.; Fazil, K. M.; Gallant, M.; Gareau, Y.; 67

Labelle, M.; Peterson, E. P.; Rasper, D. M.; Ruel, R.; Vaillancourt, J. P.; Thornberry, N.
A.; Becker, J. W. Nature structural biology 1996, 3, 619.
(30) Han, Z. Y.; Hendrickson, E. A.; Bremner, T. A.; Wyche, J. H. Journal of
Biological Chemistry 1997, 272, 13432.
(31) Stennicke, H. R.; Renatus, M.; Meldal, M.; Salvesen, G. S. The Biochemical
journal 2000, 350 Pt 2, 563.
(32) Tewari, M.; Quan, L. T.; Orourke, K.; Desnoyers, S.; Zeng, Z.; Beidler, D.
R.; Poirier, G. G.; Salvesen, G. S.; Dixit, V. M. Cell 1995, 81, 801.
(33) Roy, A. C.; Saha, N.; Tan, S. M.; Kamarul, F. Z.; Ratnam, S. S.
Electrophoresis 1992, 13, 396.
(34) Gurtu, V.; Kain, S. R.; Zhang, G. Analytical Biochemistry. 1997, 251, 98.
(35) Liu, J.; Bhalgat, M.; Zhang, C.; Diwu, Z.; Hoyland, B.; Klaubert, D. H.
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 1999, 9, 3231.
(36) Wang, Z.-Q.; Liao, J.; Diwu, Z. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters
2005, 15, 2335.
(37) Cai, S. X.; Zhang, H.-Z.; Guastella, J.; Drewe, J.; Yang, W.; Weber, E.
Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2001, 11, 39.
(38) Bullok, K.; Piwnica-Worms, D. Journal of Medicinal Chemistry. 2005, 48,
5404.
(39) Bullok, K. E.; Maxwell, D.; Kesarwala, A. H.; Gammon, S.; Prior, J. L.;
Snow, M.; Stanley, S.; Piwnica-Worms, D. Biochemistry 2007, 46, 4055.
(40) Maxwell, D.; Chang, Q.; Zhang, X.; Barnett, E. M.; Piwnica-Worms, D.
Bioconjugate Chem. 2009, 20, 702.
(41) Boeneman, K.; Mei, B. C.; Dennis, A. M.; Bao, G.; Deschamps, J. R.;
Mattoussi, H.; Medintz, I. L. Journal of the American Chemical Society 2009, 131,
3828. 68

(42) Prasuhn, D. E.; Feltz, A.; Blanco-Canosa, J. B.; Susumu, K.; Stewart, M. H.;
Mei, B. C.; Yakovlev, A. V.; Loukov, C.; Mallet, J.-M.; Oheim, M.; Dawson, P. E.;
Medintz, I. L. Acs Nano 2010, 4, 5487.
(43) Kihara, T.; Nakamura, C.; Suzuki, M.; Han, S. W.; Fukazawa, K.; Ishihara,
K.; Miyake, J. Biosensors & Bioelectronics. 2009, 25, 22.
(44) Shi, Y.; Yi, C.; Zhang, Z.; Zhang, H.; Li, M.; Yang, M.; Jiang, Q. ACS
applied materials & interfaces 2013, 5, 6494.
(45) Xu, X.; Gerard, A. L. V.; Huang, B. C. B.; Anderson, D. C.; Payan, D. G.;
Luo, Y. Nucleic Acids Research. 1998, 26, 2034.
(46) Nagai, T.; Miyawaki, A. Biochemical and Biophysical Research
Communications 2004, 319, 72.
(47) Elphick, L. M.; Meinander, A.; Mikhailov, A.; Richard, M.; Toms, N. J.;
Eriksson, J. E.; Kass, G. E. N. Analytical Biochemistry. 2006, 349, 148.
(48) Sakamoto, S.; Terauchi, M.; Hugo, A.; Kim, T.; Araki, Y.; Wada, T.
Chemical Communications. 2013, 49, 10323.
(49) Hong, Y. N.; Lam, J. W. Y.; Tang, B. Z. Chemical Communications.. 2009,
4332.
(50) Shi, H.; Kwok, R. T. K.; Liu, J.; Xing, B.; Tang, B. Z.; Liu, B. Journal of
the American Chemical Society 2012, 134, 17972.
(51) Shi, H. B.; Zhao, N.; Ding, D.; Liang, J.; Tang, B. Z.; Liu, B. Organic &
Biomolecular Chemistry 2013, 11, 7289.
(52) Ding, D.; Liang, J.; Shi, H. B.; Kwok, R. T. K.; Gao, M.; Feng, G. X.; Yuan,
Y. Y.; Tang, B. Z.; Liu, B. Journal of Materials Chemistry B 2014, 2, 231.
(53) Marme, N.; Knemeyer, J. P.; Sauer, M.; Wolfrum, J. Bioconjugate
Chemistry. 2003, 14, 1133.
(54) Marme, N.; Knemeyer, J. P.; Wolfrum, J.; Sauer, M. Angewandte Chemie-International Edition. 2004, 43, 3798.
(55) Togashi, D. M.; Szczupak, B.; Ryder, A. G.; Calvet, A.; O′Loughlin, M.
Journal of Physical Chemistry A. 2009, 113, 2757.
(56) Albert Griffin, B.; Adams, S. R.; Jones, J.; Tsien, R. Y. In Methods in
Enzymology; Jeremy Thorner, S. D. E., John, N. A., Eds.; Academic Press: 2000; Vol.
Volume 327, p 565.
指導教授 李賢明、謝發坤(Hsein-Ming Lee Fa-Kuen Shieh) 審核日期 2015-6-15
推文 facebook   plurk   twitter   funp   google   live   udn   HD   myshare   reddit   netvibes   friend   youpush   delicious   baidu   
網路書籤 Google bookmarks   del.icio.us   hemidemi   myshare   

若有論文相關問題,請聯絡國立中央大學圖書館推廣服務組 TEL:(03)422-7151轉57407,或E-mail聯絡  - 隱私權政策聲明