博碩士論文 103821011 詳細資訊




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姓名 謝東霖(Dong-Lin Hsieh)  查詢紙本館藏   畢業系所 生命科學系
論文名稱 嗜酸熱硫化葉菌的DNA結合蛋白Saci_0101之結構與功能分析
(Structural and Functional Analysis of the DNA Binding Protein Saci_0101 from the Hyperthermophile Sulfolobus acidocaldarius)
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摘要(中) 細胞內的DNA需要被蛋白質纏繞,有效地縮小尺寸以便儲存於細胞內,而古生菌分為兩類,一類是似真核生物利用相仿組織蛋白的方式形成四聚體的核小體;另一類則是似原核生物,比如在古生菌硫化葉菌屬胞內,由一群分子量7-10 KDa的染色質蛋白質(Sul10a, Sul10b, Sul7d, Sul7c),將DNA纏繞形成緊密結構。蛋白質Saci_0101通常認為是參與DNA纏繞保存的蛋白質,在此篇研究中,我們解析出了蛋白質Saci_0101兩種不同晶格的結構,解析度分別為1.30 Å和1.40 Å。從結構中可以看出,蛋白質Saci_0101與其在硫磺礦硫化葉菌中同源蛋白Sso7c4之結構相當相似,都藉由-loop-相互交聯形成二聚體的構型,而進行點突變之Saci_0101 I20M也得到解析度1.55 Å的結構,有趣的是,經過點突變之後發現到與野生型的Saci_0101相比,Saci_0101 I20M的1 helix相對較短,B-factor數值也降低至僅有14,可以明顯看出突變過後的動態特性明顯降低。在偏極化螢光分析的實驗中,發現到Saci_0101與雙股DNA的結合力為1.23  0.19 M,這與其他古生菌硫化葉菌屬的其他非特異性的雙鏈DNA結合蛋白相當接近。而利用電子顯微鏡(Electron Microscope)觀察蛋白質與DNA結合機制後,也證明了Saci_0101可以使DNA纏繞,並且具有架橋的功能。
摘要(英) Saci_0101 is commonly believed to be a histone-like protein involved in genomic DNA compaction from Sulfolobus acidocaldarius. Here, to obtain a detailed understanding of its architectural properties, we present two crystal structures of wild type Saci_0101 in different crystal forms at 1.30 Å and 1.40 Å resolution, respectively. The overall crystal structures of both wild type are similar with the homologues of Sso7c4 in S. solfataricus and have a homodimeric DNA-binding fold forming a swapped -loop- ‘Ying-Yang’ topology. The crystal structure of its single mutant, I20M also has been solved at 1.55 Å resolution. Interestingly, the single mutation by replacing Ile with Met leads to the shortening of 1 helix and even makes the mutant structure much more static than the wild type, proved by the very small B-factor of 14 in I20M structure. In fluorescence polarization study, wild type Saci_0101 binds to a 20-bp double-stranded DNA with a binding affinity of 1.23 ± 0.19 M, which is close to other nonspecific dsDNA-binding proteins in Sulfolobus species. The EM studies show Saci_0101 may shape DNA as a wrapper and a briddger, which suggests Saci_0101 play a role in DNA packaging and duplex stabilization at the elevated growth temperatures.
關鍵字(中) ★ 嗜酸熱硫化葉菌
★ DNA結合蛋白
★ DNA纏繞
關鍵字(英) ★ Sulfolobus
★ histone-like protein
★ Sso7c4
★ Saci_0101
★ DNA packing
論文目次 目 錄
中文摘要 i
Abstract ii
致謝 iii
目錄 iv
圖目錄 vii
表目錄 viii
縮寫檢索表 ix
第一章 緒論 1
1-1 菌種 1
1-1-1古細菌域 1
1-1-2古生菌硫化葉菌屬 2
1-2 DNA結合蛋白 3
1-2-1古細菌中的DNA結合蛋白 3
1-2-2蛋白質Sso7c4和蛋白質Saci_0101 3
1-2-3 DNA結合蛋白質的構築功能 5
1-3 研究動機 6
第二章 材料與方法 7
2-1 建構目標蛋白質基因與載體 7
2-1-1 嗜酸熱硫化葉菌之菌株培養與全基因體萃取 7
2-1-2 聚合酶鏈鎖反應引子(PCR Primer)設計 9
2-1-3 聚合酶鏈鎖反應擴增目標基因 10
2-1-4 利用膠體電泳確認目標基因片段 11
2-1-5 純化基因片段 12
2-1-6 剪切反應(Digestion) 12
2-1-7 接合反應(Ligation) 12
2-1-8 轉型作用(Transformation) 13
2-1-9 基因定序 13

2-2 目標蛋白質之大量表現 15
2-2-1 測試最佳蛋白質表現條件 15
2-2-2 聚丙烯醯胺膠體電泳 15
2-2-3 大量表現蛋白質 16
2-3 目標蛋白質之純化 17
2-3-1 超音波震盪破菌 17
2-3-2 加熱純化 17
2-3-3 利用快速蛋白質液相層析儀純化蛋白質 17
2-3-4 冷凍乾燥 18
2-4 利用X-ray晶體繞射技術解析蛋白質之結構 19
2-4-1 預結晶試驗(Pre-Crystallization Test) 19
2-4-2 蛋白質結晶條件篩選 20
2-4-3 收集繞射數據 20
2-4-4 解決相位問題 21
2-4-5 結構的建立與優化 22
2-5 點突變(Site-Directed Mutagenesis) 23
2-5-1 點突變I20M 23
2-5-2 利用溶解度觀察蛋白質動態 24
2-6 蛋白質與DNA作用機制分析 25
2-6-1 偏極化螢光分析 25
2-6-2 利用電子顯微技術觀察蛋白質與DNA結合機制 25
第三章 結果 26
3-1 建構目標蛋白質基因與載體 26
3-2 蛋白質表現條件測試 27
3-3 測試蛋白質耐熱特性 28
3-4 利用陽離子交換樹脂層析純化蛋白質 29
3-5 預結晶試驗 31
3-6 蛋白質結晶條件篩選 32
3-7 蛋白質Saci_0101與點突變Saci_0101 I20M之結構描述 33
3-8 偏極化螢光分析 36
3-9 利用電子顯微技術觀察蛋白質與DNA結合機制 37
第四章 討論 39
4-1 蛋白質Saci_0101結構 39
4-2 點突變Saci_0101 I20M影響蛋白質動態 40
4-3 偏極化螢光DNA結合力分析 41
4-4 蛋白質與DNA結合機制 42
參考文獻 43
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指導教授 陳青諭(Chin-Yu Chen) 審核日期 2016-7-27
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