紫質衍生物研究：間位苯卟啉分子的鋅離子感測及大環紫質的構型

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江佩純(Pei-Chun Chiang) 查詢紙本館藏

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化學學系

論文名稱

紫質衍生物研究：間位苯卟啉分子的鋅離子感測及大環紫質的構型
(Study of Porphyrin Analogue: Application of m-Benziporphodimethene Toward In-Vitro Zinc Sensing and Structural Diversity of [38]-N4S4-Octaphyrin)

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摘要(中)

鋅是人體內所有細胞中不可或缺的礦物質，人體內超過兩百種酵素都含有鋅，它們是人體中許多化學反應的催化劑。合成一系列類紫質衍生物─間位苯卟啉分子(m-Benziporphodimethene，BPDM)，做為對鋅離子具高度選擇性的螢光感測分子；當BPDM分子和Zn2+形成配位化合物後，利用長波長的激發，可使鋅錯合物由CHEF (chelation-enhanced fluorescence)效應，放射出長波長的螢光。本研究以高效能共軛焦顯微鏡(confocal microscope)進行間位苯卟啉鋅錯合物在HeLa細胞內染色和間位苯卟啉分子對HeLa細胞內鋅離子的感測觀察；另外，藉由MTT細胞活性染色法(MTT assay)配合ELISA reader測量24小時中極性非質子溶劑DMSO和BPDM-COOH分子對HeLa細胞株毒性測試，也以etoposide為誘導分子利用BPDM-COOH分子進行凋亡細胞的感測實驗。
在本論文第二章中，合成含四氮四硫的紫質大環化合物[38]octaphyrin(1,1,1,1,1,1,1,1)，並以一維1H NMR及二維1H−1H COSY、1H−13C HSQC、1H−13C HMBC NMR光譜以及單晶X-ray結構進行鑑定；並且利用變溫1H NMR光譜研究溫度對分子結構及環電流的影響。另外，藉由UV-Vis光譜和1H NMR光譜可知以過氯酸(HClO4)進行質子化反應造成[38]N4S4-octaphyrin構型的變化及芳香性提高。

摘要(英)

Zinc is an essential metal ion in biology system. Over two hundred enzymes contain zinc in their active site in human body. They play important roles in bio-relate catalytic reactions. In this thesis, we demonstrate a new porphyrin analogue, m-benziporphodimethene (BPDM), as a highly selective fluorescence sensor for zinc ion. When zinc(2+) coordinated with BPDM to form a stable metal complex, the excitation by long wavelength light emits
long wavelength fluorescence through chelation-enchanced fluorescence effect. To confirm the penetration of compounds into cells, we treat BPDM-Zn into medium of HeLa cell before incubation and detect the fluorescence by a high performance confocal microscope. In addition, we study the 24 hours cell toxicity of DMSO and BPDM-COOH in HeLa cell measured by MTT assay and ELISA reader. Finally, we also utilized BPDM-COOH as a sensor to trace the apoptotic process in HeLa cell. In the second chapter, we successfully synthesize a heteroatom substituted expanded porphyrin, [38]octaphyrin(1,1,1,1,1,1,1,1), embeding four nitrogen atoms and four sulfur atoms in the central core, which confirmed by one dimension 1H NMR, two dimensions 1H−1H COSY, 1H−13C HSQC, 1H−13C HMBC NMR spectra and single crystal structure. Interestingly, variable temperature 1H NMR experiment demonstrated a temperature dependent molecular structure ring current changes. Additionally, protonation by HClO4 also affects the structure and aromaticity of [38]N4S4-octaphyrin according to UV-vis and 1H−NMR spectroscopic data.

關鍵字(中)

★ 紫質衍生物

關鍵字(英)

★ Porphyrin Analogue

論文目次

目錄
章節頁次
圖目錄 III
表目錄 VII
式目錄 VIII
Abstract IV
摘要 X
第一章間位苯卟啉分子的鋅離子感測 1
1-1 前言 1
1-2 實驗背景與原理 10
1-3 材料與方法 14
1-3-1 細胞株 14
1-3-2 實驗儀器 15
1-3-3 藥品 15
1-3-4 溶液配製 15
1-4 實驗方法 17
1-4-1 細胞株培養 17
1-4-2 DMSO對HeLa細胞的毒性測試 17
1-4-3 鋅離子感測 18
1-4-4 BPDM-COOH對HeLa細胞的毒性測試 20
1-4-5 細胞觀察 21
1-5 結果與討論 21
1-5-1 利用MTT分析DMSO(dimethyl sulfoxide)濃度對HeLa細胞的毒性測試 21
1-5-2 觀察間位苯卟啉鋅錯合物進入HeLa細胞的狀況 23
1-5-3 在HeLa細胞內進行鋅離子感測實驗 27
1-5-4 利用BPDM-COOH追蹤細胞凋亡過程 29
1-5-5 利用MTT分析BPDM-COOH濃度對HeLa細胞的毒性測試 32
1-6 結論 33
參考文獻 34
第二章含硫大環紫質的合成與鑑定 36
2-1 關於octaphyrins的合成 36
2-2 環狀共軛分子的芳香性(aromaticity) 42
2-3 研究動機與方向 47
2-4 實驗步驟 47
2-4-1 實驗藥品 47
2-4-2 儀器設備 47
2-4-3 合成2,5-bis(2,6-dichlorobenzylhydroxymethyl)thiophene (Cl2-diol) 48
2-4-4 5,10,15,20,25,30,35,40-octa(2,6-dichlorophenyl)-41,43,45,47-tetrathiaoctaphyrin(1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1) ([38]N4S4-octaphyrin)合成 49
2-5 結果與討論 50
2-5-1 [38]N4S4-Octaphyrin的合成與光譜鑑定 50
2-5-2 質子化的[38]N4S4-octaphyrin光譜與結構討論 68
2-5-3 鹼基態與質子化[38]N4S4-octaphyrin的Uv-vis光譜比較 72
2-6 結論及展望 74
參考文獻 76
圖目錄
圖1-1 螢光感測分子的PET發光機制 4
圖1-2 PET類型的感測分子 4
圖1-3 (DPA-C2)2-TPPS3紫質衍生物 5
圖1-4 HEK-293細胞經過5 μM (DPA-C2)2-TPPS3培養24小時的螢光影像照片，細胞核使用Hoechst 33258藍色染劑標示。(A)細胞內沒有外加鋅離子；(B)細胞先經過40 μM zinc/pyrithione培養10分鐘。 6
圖1-5 螢光感測分子的PCT發光機制 6
圖1-6 以推電子基為辨識單元PCT感測分子 7
圖1-7 以拉電子基為辨識單元的PCT感測分子 8
圖1-8 ZnIC螢光感測分子結構 8
圖1-9 左邊部分為HEK-293細胞經過10 μM ZnIC培養30分鐘。其中左圖為不含外加鋅離子的細胞控制組；中間圖為經過50 μM Zn2+培養5分鐘後的細胞實驗組；右圖為加入300 μM TPEN細胞實驗組。 9
圖1-10 TPEN結構(N,N,N’,N’-Tetrakis-(2-pyridylmethyl)-Ethylenediamine) 9
圖1-11 感測分子bisanthraceno-crown ether 10
圖1-12 螢光感測分子m-Benziporphodimethene 11
圖1-13 m-Benziporphodimethene晶體結構 12
圖1-14 在acetonitile溶劑下加入不同金屬離子和BPDM作用產生螢光訊號 13
圖1-15 BPDM金屬錯合物的螢光光譜 13
圖1-16 BPDM衍生物 14
圖1-17 間位苯卟啉分子及間位苯卟啉鋅錯合物 15
圖1-18 MTT細胞活性染色法實驗流程 18
圖1-19 不同DMSO含量對HeLa細胞毒性測試(24小時) 22
圖1-20 HeLa細胞加入間位苯卟啉鋅錯合物培養30分鐘，分別進行光學及螢光顯微鏡觀察分析，細胞核使用DAPI藍色染劑標示。 24
圖1-21A 經過10-4 M BPDM-Zn錯合物培養30分鐘的HeLa細胞，在螢光顯微鏡下不同高度的細胞切面觀察分析 25
圖1-21B 經過10-4 M BPDM-COOMe-Zn錯合物培養30分鐘的HeLa細胞，在螢光顯微鏡下不同高度的細胞切面觀察分析 26
圖1-21C 經過10-4 M BPDM-NO2-Zn錯合物培養30分鐘的HeLa細胞，在螢光顯微鏡下不同高度的細胞切面觀察分析 26
圖1-22 HeLa細胞加入BPDM-COOH-Zn培養30分鐘，分別進行光學及螢光顯微鏡觀察分析，細胞核使用DAPI藍色染劑標示。 27
圖1-23 HeLa細胞螢光影像照片。(A) 加入10-4 M BPDM-Zn培養30分鐘；(B)加入10-4 M BPDM-COOH-Zn培養30分鐘。 27
圖1-25 加入10-4 M etoposide利用光學顯微鏡觀察HeLa細胞形態的改變 30
圖1-26 不同濃度BPDM-COOH對HeLa細胞進行細胞毒性測試(24小時) 32
圖1-27 不同濃度BPDM-COOH對HeLa細胞進行細胞毒性測試(24小時) 33
圖2-1 [36]Octaphyrin(2.1.0.1.2.1.0.1)結構 36
圖2-2 [36]Octaphyrin(2.1.0.1.2.1.0.1)質子化的晶體結構 37
圖2-3 [34]Octaphyrin(1.1.1.0.1.1.1.0)晶體結構 37
圖2-4 [32]Octaphyrin(1.0.1.0.1.0.1.0) 38
圖2-5 [32]Octaphyrin(1.0.0.0.1.0.0.0)雙質子化的晶體結構 39
圖2-6 [30]Octaphyrin(0.0.0.0.0.0.0.0)質子化的晶體結構 39
圖2-7 [34]Octapyrin(1.0.1.0.1.0.1.0)晶體結構 40
圖2-8 [34]Octaphyrin(1.1.0.0.0.1.1.0)晶體結構 41
圖2-9 [34]Octaphyrin(1.1.1.0.1.1.1.0) 晶體結構(左：側視圖；右：俯視圖) 41
圖2-10 Mobius strip構型示意圖 43
圖2-11 Huckel及Mobius的分子系統 43
圖2-12 [16]Annulenes的Mobius分子系統 44
圖2-13 紫質衍生物di-p-benzi[28]hexaphyrin(1.1.1.1.1.1) 45
圖2-14 金屬化的meso-aryl-substituted expanded porphyrins 46
圖2-15 紫質衍生物meso-aryl-substituted [32]heptaphyrins(1.1.1.1.1.1.1) 46
圖2-16 meso-Aryl-substituted [32]heptaphyrins(1.1.1.1.1.1.1)與TFA的氫鍵作用 46
圖2-17 鹼基N4S4-octaphyrin單晶結構(省略氫原子) 51
圖2-18 鹼基N4S4-octaphyrin具一C2對稱軸(省略氫原子) 52
圖2-19 鹼基N4S4-octaphyrin在「8」字形結構的交叉點處為兩個翻轉pyrrole環 52
圖2-20 鹼基N4S4-octaphyrin側面圖 53
圖2-21 N4S4-Octaphyrins之1H NMR光譜(chloroform-d) 53
圖2-22 N4S4-Octaphyrins三類氫原子 54
圖2-23 N4S4-Octaphyrins之1H−13C HSQC光譜 54
圖2-24「8」字型的N4S4-octaphyrin有一個C2對稱 56
圖2-25 N4S4-Octaphyrins在6−7.8 ppm之1H-1H COSY光譜(chloroform-d) 56
圖2-26 N4S4-Octaphyrins之1H-13C HSQC光譜(chloroform-d) 57
圖2-27 N4S4-Octaphyrins在4.2−7.8 ppm之1H−1H COSY光譜 57
圖2-28 N4S4-Octaphyrins在NMR光譜上之β位置的氫訊號 58
圖2-29 N4S4-Octaphyrins由1H-13C HSQC(紅色)和HMBC(黑色)光譜疊圖找出β-Hthiophene和β-Hpyrrole的訊號(chloroform-d) 59
圖2-30 N4S4-Octaphyrins之β-protons偶合常數(coupling constant) 60
圖2-31 N4S4-Octaphyrins之β-Hpyrrole及β-Hthiophene化學位移(chemical shift) 60
圖2-32A N4S4-Octaphyrins由1H-13C HSQC(紅色)和HMBC(黑色)光譜疊圖找出β-H的訊號 62
圖2-32B N4S4-Octaphyrins由1H-13C HSQC(紅色)和HMBC(黑色)光譜疊圖找出β-H的訊號 63
圖2-33 N4S4-Octaphyrins由1H-13C HSQC(紅色)和HMBC(黑色)光譜疊圖找出四組m-Hphenyl的訊號 64
圖2-34 N4S4-Octaphyrins由1H-1H COSY光譜找出p-Hphenyl的訊號 65
圖2-35 N4S4-Octaphyrins由1H-1H COSY光譜找出各組p-Hphenyl的訊號 66
圖2-36 N4S4-Octaphyrins所有氫原子的化學位移(chemical shift) 67
圖2-37 1H NMR變溫實驗(223−323K) 68
圖2-38 [N4S4][ClO4]2之1H NMR光譜(chloroform-d) 69
圖2-39 [N4S4][ClO4]2單晶結構 70
圖2-40 [N4S4][ClO4]2其各原子偏離其平均平面的情形 71
圖2-41 [N4S4][ClO4]2晶體結構 71
圖2-42 [N4S4][ClO4]2內β-Hpyrrole…O-Cl氫鍵 72
圖2-43 N4S4-Octaphyrin之UV-Vis吸收光譜及質子化的衍生物(CH2Cl2) 73
表目錄
表1-1 BPDM衍生物吸收及螢光波長比較表 14
表1-2 實驗藥品的貯備溶液配製 16
表1-4A 細胞染色實驗條件 18
表1-4B 細胞染色實驗條件 19
表1-5 鋅離子感測實驗條件 19
表1-6 不同濃度的BPDM-COOH培養液 21
表1-8 BPDM-COOH分子辨識凋亡細胞觀察 31
表2-1 在不同溶劑下N4S4-octaphyrin的主要吸收峰變化 72
表2-2 Crystal Data and Structure Refinement for N4S4-octaphyrin 75
式目錄
式1-1 BPDM(m-benziporphodimethene)合成步驟 11
式2-1 合成[36]octaphyrin(2.1.0.1.2.1.0.1) 37
式2-2 合成[34]octaphyrin(1.1.1.0.1.1.1.0) 37
式2-3 合成[32]octaphyrin(1.0.0.0.1.0.0.0) 38
式2-4 合成[30]octaphyrin(0.0.0.0.0.0.0.0) 39
式2-5 合成[34]octapyrin(1.0.1.0.1.0.1.0) 40
式2-6合成[34]octaphyrin(1.1.0.0.0.1.1.0) 40
式2-7合成[34]octaphyrin(1.1.1.0.1.1.1.0) 41
式2-8 N4S4-Octaphyrin反應方程式 50

參考文獻

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(13) Saito, S.; Shin, J-Y., Lim, J. M.; Kim, K. S.; Kim, D.; Osuka, A. Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9657.

指導教授

侯敦仁、洪政雄
(Duen-Ren Hou、Chen-Hsiung Hung)

審核日期

2009-7-20

推文