探討樟芝發酵生產Aflatoxin B1解毒酵素與純化

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林育成(You-Chen Lin) 查詢紙本館藏

畢業系所

化學工程與材料工程學系

論文名稱

探討樟芝發酵生產Aflatoxin B1解毒酵素與純化

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摘要(中)

在現今的食品當中，潛藏著許多對人體造成健康危害的毒素，這些毒素來源有：黴菌毒素、細菌類毒素、重金屬毒素、農藥和化學污染等等，對人體可是造成疾病的發生。其中黃麴毒素AFB1為黴菌毒素的一種，主要污染來源為豆類食品。在毒性上，相對於其它具有相似結構的黃麴毒素，被認為是毒性較強的黴菌毒素。從文獻上，也發現在真菌類當中，具有其降低AFB1毒性的解毒酵素，反應後發現在螢光下偵測其AFB1吸收值降低。因此在實驗研究中，也希望能從真菌類樟芝發酵中，找出具有可降低AFB1毒性的解毒酵素。
本研究以樟芝Antrodia camphorata BCRC 35396於氣舉式發酵槽培養下，找尋具有降低毒素毒性的解毒酵素，其反應上造成AFB1螢光降低，並將發酵液進行酵素分離純化。
解毒酵素的純化步驟是將發酵澄清液利用硫酸銨沉降、透析，再經過DEAE Sepharose陰離子交換管柱層析分離純化。最後由SDS-PAGE電泳分析，找出此解毒酵素分子量為54kDa。
在反應部份，則是將純化之酵素與AFB1反應，利用AFB1在螢光excitation 365nm偵測下，emission 420nm 會有吸收值，來作為判斷毒素反應變化情況。

關鍵字(中)

★ 解毒酵素
★ 樟芝
★ 發酵
★ 黃麴毒素

關鍵字(英)

★ aflatoxins
★ detoxifizyme
★ Antrodia Camphorate
★ fermentation

論文目次

第一章緒論…………………………………………………………….1
1-1研究動機………………………………………………………..1
1-2研究目的………………………………………………………..2
第二章文獻回顧………………………………………………………..3
2.1菇類的介紹…….………………………………………………..3
2.2樟芝……………………………………………………………...3
2.2.1分類…………….…………………………………………...3
2.2.2型態…………………………………..……………….…….4
2.2.3成分……………..…………………………………………..6
2.2.4功用…………………………………………………………6
2.2.5樟芝之藥理作用……………………………………………7
2.3黃麴毒素……………………………………………………….10
2.3.1黃麴毒素簡介……………………………………………..10
2.3.2黃麴毒素結構……………………………………………11
2.3.3黃麴毒素分析方法…..………………………………......12
2.4解毒酵素………………………………………………………13
2.4.1酵素簡介………………………………………………….13
2.4.2解毒酵素與黃麴毒素反應………………………………..16
2.5酵素之分離與純化…………………………………………….19
2.5.1濃縮方法…………………………………………………..19
2.5.1.1離心…………………………………………………...19
2.5.1.2超微薄膜過濾法……………………………………...20
2.5.1.3其他濃縮方法…………………………………….......21
2.5.1.4層析法…………………………………………….......21
2.5.1.4.1離子交換管柱層析…………………………........22
2.5.1.4.2疏水性作用管柱層析……………………………23
2.5.1.4.3親和性作用管柱層析……………………………23
2.5.1.4.4膠體過濾管柱層析………………………………24
2.5.2快速蛋白質液相層析儀(FPLC)………………….....24
第三章實驗材料與方法………………………………………………26
3.1實驗材料……………………………………………………….26
3.1.1實驗菌株…………………………………………………..26
3.1.2實驗藥品…………………………………………………..26
3.1.3實驗儀器及其他設備…………………………………….27
3.1.4實驗裝置.............................................................................28
3.2實驗方法………………………………………………….........29
3.2.1菌株保存…………………………………………………..29
3.2.2培養基組成.………………………………………………29
3.2.3操作條件…………………………………………………..30
3.2.4分析方法…………………………………………………..31
1.發酵液處理流程……………………………………………..31
2.菌重分析………………………………………………………32
3.葡萄糖殘量分析……………………………………………....32
4.硫酸銨沉降……………………………………………………33
5.管柱層析………………………………………………….........36
6.解毒酵素與AFB1反應分析方法……………………………..37
7.蛋白質含量測定.........................................................................38
8.SDS膠體電泳（SDS-PAGE）……………………………......39
第四章結果與討論…………………………………………………......43
4.1樟芝菌絲型態…………………………………………………..43
4.1.1固態培養……………………………………………………43
4.1.2搖瓶培養……………………………………………………44
4.1.3氣舉式發酵槽………………………………………………44
4.2發酵槽實驗……………………………….................................46
4.3黃麴毒素AFB1分析……………………………………… ..….47
4.4解毒酵素之純化………………………………………..………48
4.4.1解毒酵素純化動機………………………………………..48
4.4.2發酵澄清液………………………………………………..50
4.4.3陰離子交換管柱層析……………………………………..51
4.4.4 SDS膠體電泳（SDS-PAGE）……………………………52
4.5 解毒酵素與AFB1反應分析………………………………….54
第五章結論與未來展望……………………………………………….55
5-1結論……………………………………………………………..55
5-2未來建議………………………………………………………..56
參考文獻………………………………………………………………....57

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呂鋒洲，“黴菌毒素，國立編譯館主編"。

指導教授

徐敬衡(Chin-Hang Shu)

審核日期

2005-7-20

推文