研究TDP-43蛋白質中澱粉樣胜肽之聚集化特性

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蔡侑儒(Yu-Ju Tsai) 查詢紙本館藏

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化學學系

論文名稱

研究TDP-43蛋白質中澱粉樣胜肽之聚集化特性
(The Aggregation Properties of Amyloidogenic Peptides in TDP-43)

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摘要(中)

蛋白質與胜肽因為不正常堆疊在組織內形成斑塊是許多神經退化性疾病的病徵。在2006年的時候，TAR DNA-binding Protein 43 (TDP-43) 被辨識出為肌萎縮性脊隨側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) 和額顳葉退化症 (Frontotemporal Lobar Degeneration, FTLD) 病理堆積物的主要成分。由於TDP-43蛋白質的C端與Sup35蛋白質的N端有一定的相似性，被推斷可能具有與Prion disease一樣強烈感染的特性。因此，為了驗證TDP-43是否具有類普恩蛋白 (Prion-like) 的特性，我們利用固相胜肽合成法 (Solid Phase Peptide Synthesis) 合成出富含麩醯胺酸 (Glutamine, Q) 和天門冬醯胺酸 (Asparagine, N) 的胜肽片段，然後對其做一系列澱粉樣蛋白特性以及引晶效應之測試，包括圓二色光譜、硫磺素T染色、穿透式電子顯微鏡觀測、無細胞表達系統以及細胞內效應，希望藉由觀測Q/N rich胜肽的特性使我們更為了解TDP-43蛋白質在ALS和FTLD所扮演的腳色。雖然在現今我們知道澱粉樣蛋白特性對於神經退化性疾病的病理學研究十分重要，然而對於澱粉樣蛋白特性在細胞或是組織內初期的特性卻尚未明朗，因此在本篇研究我們採取光控制的策略，設計了一條能夠利用紫外光驅動澱粉樣蛋白特性產生的胜肽，此胜肽在照光前能夠自組裝形成球體型態增加其進入細胞的能力。另外，藉由紫外光控制具有澱粉樣蛋白特性之胜肽在特定的時間及區域產生引晶效應，驅使細胞內的TDP-43蛋白質錯位 (mislocalized) 產生聚集化現象，這樣的設計使我們更加了解澱粉樣蛋白特性對於ALS和FTLD的影響。此種光控制胜肽的設計概念未來也能應用在其他神經退化性疾病，成為了一極具潛力的疾病模型。

摘要(英)

The abnormal assembly of misfolded proteins or peptides into neurotoxic amyloid aggregates is a hallmark associated with many neurodegenerative diseases. In 2006, TAR DNA-binding protein (TDP-43) was first identified as a major component in the inclusions of patients with either amyotrophic lateral sclerosis (ALS) or frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin-positive inclusion (FTLD-U). The strong tendency of the C-terminus of TDP-43 to form aggregates is likewise consistent with the behavior of a prion-related Q/N domain containing protein. In this study, we designed and synthesized the Q/N-rich polypeptides from the TDP-43 C-terminus with solid phase peptide synthesis (SPPS). Furthermore, their amyloid properties were characterized by electron microscopy (EM), circular dichroism (CD), thioflavin T assay, cell-free system and cultured cell observation. Although the importance of amyloid has been widely recognized in the pathogenesis of neurodegenerative diseases, the early phase of amyloidogenesis in cells or tissues remain obscure. To address this end, we employ a light-assisted strategy to develop a peptide that undergoes a fast amyloidogenesis upon UV illumination. Moreover, before photolysis, this photocontrollable peptide tends to self-assemble and adopt spherical vesicles, which is believed to confer cell-penetrating properties. Provided that the phototractable peptide can induce TDP-43 aggregates spatiotemporally, this design allows us to better understand amyloidogenesis in vivo. Such a light-assisted design has great potential to serve as a disease model of ALS or FTLD and seems applicable to other neurodegenerative diseases.

關鍵字(中)

★ 聚集化
★ 澱粉樣特性胜肽
★ TDP-43

關鍵字(英)

★ Aggregation
★ Amyloidogenic Peptide
★ TDP-43

論文目次

目錄
摘要 VI
Abstract VIII
誌謝 IX
目錄 XI
圖目錄 XV
表目錄 XVIII
附件目錄 XVIII
縮寫表 XIX
第一章緒論 1
1.1 神經退化性疾病 (Neurodegenerative Diseases, NDDs) 1
1.2 肌萎縮性脊髓側索硬化症 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) 3
1.3 TAR DNA-binding Protein-43 5
1.3.1 TAR DNA-binding Protein-43 5
1.3.2 TDP-43聚集化現象與其C端的關係 6
1.3.3 TDP-43聚集化現象與澱粉樣蛋白特性以及引晶效應的關係 8
1.4 澱粉樣纖維性質 10
1.5 光控制澱粉樣纖維聚集化現象 11
第二章實驗儀器與材料 12
2.1 實驗儀器 12
表2.1 儀器表 12
2.2 實驗材料 14
表 2.2 藥品表 14
第三章實驗方法 16
3.1 胜肽樣品製備 (合成、純化與鑑定) 16
3.1.1 固相胜肽合成法 (SPPS) 16
3.1.2 高效液相層析 21
3.1.3 基質輔助雷射脫附游離質譜法 (MALDI mass spectrometry) 23
3.2 胜肽樣品定性分析 25
3.2.1 穿透式電子顯微鏡 (TEM) 25
3.2.2 圓二色光譜 (CD) 26
3.2.3 Thioflavin T染色螢光光譜 (fluorescence spectrometry) 28
3.2.4 拉曼光譜 (FT-Ramen spectrometry) 29
3.3 晶種製備 30
3.4 無細胞系統測試 (Cell-free system) 32
3.5 胜肽樣品螢光標記 34
3.6 微注射系統與即時螢光影像觀測 35
3.7 共軛焦螢光顯微鏡觀測 36
3.8 動態光散射量測 (DLS) 36
3.9 全反射螢光影像觀測 (TIRF) 37
3.10 細胞培養、TDP-43蛋白質表達 38
第四章實驗結果與討論 (Part I) 39
4.1 胜肽的純化與鑑定 39
4.2 胜肽樣品性質鑑定結果 39
4.2.1 胜肽細微影像觀測 (TEM) 39
4.2.2 胜肽二級結構變化 (CD) 41
4.2.3 胜肽之澱粉樣蛋白性質鑑定 (Thioflavin T螢光吸收) 42
4.2.4 胜肽二級結構組成比較 (FT-Raman) 45
4.3 澱粉樣蛋白特性胜肽樣品之引晶效應測試 (Cell-free system) 46
4.4 胜肽樣品之螢光標記 49
4.5 胜肽樣品分別與表達EGFP-TDP-43和EGFP-TDP208-414蛋白質細胞作用之即時螢光影像觀測 50
第五章實驗結果與討論 (PART II) 55
5.1 光控制胜肽的純化與鑑定 55
5.2 光控制胜肽之螢光標記 55
5.3 光控制胜肽之結構特性觀測 56
5.4 光控制澱粉樣纖維形成之觀測 59
5.5 光控制胜肽誘導細胞內生性TDP-43蛋白質聚集化現象 62
5.6 從時間及空間解析上來觀測澱粉樣蛋白特性以及TDP-43蛋白質在細胞質的聚集化現象 63
5.7 光誘導產生之聚集體造成Ran蛋白質錯位以及妨害蛋白質在細胞內的質核傳輸 65
第六章總結 67
參考文獻 70
附錄 72

圖目錄
圖 1.1 神經退化性疾病發病區塊及組織特徵示意圖 3
圖 1.2 正常的運動神經元與ALS患者的運動神經元 5
圖 1.3 神經細胞與TDP-43蛋白質序列示意圖 6
圖 1.4 表達TDP-43 WT與各種長度之CTFs 7
圖 1.5 TDP-43 Gly-rich domain中具澱粉樣蛋白特性之胜肽 8
圖 1.6 TDP-43 C-terminus具有誘導TDP-43蛋白質聚集化的引晶效應 9
圖3.1 R. B. Merrifield在1963年時發表在JAC的固相胜肽合成方法 17
圖3.2 固相胜肽合成法所使用的兩種保護基系統 19
圖 3.3 固相胜肽合成步驟示意圖 20
圖 3.4 基質輔助雷射脫附質譜法示意圖 25
圖 3.5 負染色法原理示意圖 26
圖 3.6 (左)二級結構之虛擬圖譜；(右)蛋白質二級結構CD吸收光譜波長
28
圖 3.7 ThT染劑作用原理 29
圖 3.8 晶種製備示意圖 31
圖3.9 (左)螢光染劑5(6) – TAMRA, SE；(右) 螢光染劑Alexa Fluor® 568 C5 Maleimide 35
圖 4.1 各胜肽在PBS溶液中 (50μM、pH 7.4) 之TEM影像觀測 40
圖4.2 圓二色光譜二級結構光譜圖 41
圖 4.3 各胜肽樣品之CD量測結果 42
圖 4.4 Congo red和Thioflavin T (ThT) 結構式 43
圖 4.5 ThT螢光激發與放射光譜(a) ThT only (b)與澱粉樣纖維鍵結後之訊號 43
圖 4.6 ThT染色螢光光譜結果 44
圖 4.7 不同二級結構在Amide I region的頻率範圍 45
圖 4.8分析纖維二級結構組成比例之拉曼光譜結果 46
圖 4.9 TDP-43WT蛋白質與QN1晶種共同表達24小時的結果 47
圖 4.10 各胜肽樣品晶種對於TDP-43WT、TDP 1-207和TDP 208-414蛋白質的引晶效應測試 48
圖 4.11 QN1與scQN1晶種分別對於TDP-43蛋白質的引晶效應測試 49
圖 4.12 螢光顯微鏡和DIC觀測微注射前後細胞型態以及樣品位置 51
圖 4.13 表達EGFP-TDP-43和EGFP-TDP208-414蛋白質之細胞在微注射胜肽樣品後連續即時觀測16小時的結果 53
圖 4.14 scQN1胜肽樣品對於表達蛋白EGFP-TDP-43作用的即時影像觀測結果 54
圖 5.1 JHR1照光與未照光情況下TEM細微影像觀測結果 57
圖 5.2 JHR1在細胞實驗的濃度下照光與未照光之DLS測量結果 58
圖 5.3 全反射螢光影像動態觀測澱粉樣纖維生成 61
圖 5.4 光控制胜肽誘導原生性的TDP-43蛋白質產生聚集化現象 63
圖 5.5 藉由特殊針孔的設置有效控制光控制胜肽在特定區域產生引晶效應 64
圖 5.6 即時螢光影像觀測JHR2誘導EGFP-TDP-43蛋白質包涵體之生成
65
圖 5.7 照光前後光控制胜肽對於Ran蛋白質之影響 66

表目錄
表 2.1 儀器表 12
表 2.2 藥品表 14
表 3.1 高效液相層析儀使用溶劑 22
表3.2 無細胞系統內所使用之材料與比例 34
表 4.1 分析胜肽樣品二級結構組成比例 46
表 5.1 JHR1在細胞實驗的濃度下照光與未照光之DLS測量結果 58

附件目錄
附件一 72
附件二 73

參考文獻

參考文獻
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指導教授

黃人則、謝發坤(Jen-Tse Huang Fa-Kuen Shieh)

審核日期

2016-7-7

推文